隨著對生物芯片技術的看好,有很多個不同的名詞來描述它。一般稱之為微矩陣(Microarray)或“生物芯片(BioChip)”,雖然“基因芯片(gene chip)”這個詞也常用,但是GeneChip是美國Affymetrix公司已注冊的基因分析研究用的微矩陣的專利商標名。
一般地,生物芯片可分為DNA芯片,蛋白芯片和Lab-on-chip。DNA芯片和蛋白芯片的承載體一般是固體基片,最常用的是經化學或生物學方法處理的玻璃片。所固定的靶標是DNA(cDNA或人工合成的寡核苷酸)或者是蛋白質。這兩種芯片技術中的檢測樣本的提取、分離、標記、雜交和信號檢測是在不同的技術平臺上進行的,而Lab-on-chip則是合成了所有的這些步驟在一個技術平臺上進行,實現了對樣品處理、提純、反應、檢測、分析的整合、微型化、自動化。生物芯片技術也可以分成兩部分:硬件(技術平臺)和軟件(檢測的對象和分析方法)。
目前最成熟的、應用最多的是DNA芯片,蛋白芯片的進展勢頭非常看好但距大規模的應用仍有一定距離,而Lab-on-chip離實用階段則更遠一些,但是它在臨床上的應用前景是最值得關注的。有關的評估可以從國際上芯片應用研究的成果進行檢索就可以得到。在這里主要對DNA芯片進行分析,以此來分析和展望蛋白芯片及Lab-on-chip的發展前景和可能對人們生活的影響。
DNA微矩陣是一種高通量的技術,它滿足了基因組計劃實施后人們進行基因功能研究的要求,可以從mRNA水平上來了解基因的功能,這是聯系DNA和蛋白質研究的重要一環。通過標記的cDNAs(從樣本中抽提出的mRNA反轉錄得到)與固定在基片上的靶標進行雜交,然后通過芯片掃描儀來掃描檢測分析雜交情況,最后通過芯片數據分析軟件分析基因表達情況。根據固定的靶標(cDNA或寡聚核苷片段)不同,可以用來檢測分析基因的表達水平和特定DNA片段的單核苷多態性(SNPs)。這是DNA微矩陣檢測的兩個主要對象。其具體的技術過程如下:
1)矩陣的構建。芯片上的靶標可以是cDNAs(部分或完整的),基因組DNAs,或者是化學合成的寡核苷酸序列。
2)探針的準備。從樣本中抽提出mRNA,反轉錄成熒光標記的cDNA;或者是特定的DNA片段以用于檢測SNPs。
3)探針與矩陣的雜交。來自兩個樣本的探針混合在一起,與芯片上的互補序列進行。就如傳統的核酸雜交,雜交條件經過優化使得背景最小。未結合上的探針在掃描前被沖洗掉。
4)掃描和檢測。用激光共聚焦的掃描儀來掃描雜交后的矩陣,每種熒光染料需要特定波長的激光去激發它。熒光信息存儲在電腦中,并進行分析和圖象建設。
5)標準化和數據分析。對每一種染料掃描后的圖象通過一定的軟件處理并合并得到每個點的重疊圖,并通過對照點來幫助校正兩種熒光染料的標記差異和檢測效率。最后用數據分析方法進行數據挖掘,主要是通過數據模型來處理。
通過DNA微矩陣技術相對簡單地使研究工作者來檢測特定時空條件下的生物體的所有基因的表達成為可能。雖然人們認識到自己能表達的所有基因數只有30000個,但是它們的信息量仍是非常巨大的。通過微矩陣技術將產生大量的信息,從這些信息中將可以提取到很多非常有價值的材料。基于這些材料之上,科學工作者可以提出相關的設想和實驗設計,并通過其他的實驗來證明它。微矩陣技術正如“基因信息海”中的一張“網”,智者將會網到“魚”。
目前,DNA芯片應用于科研領域取得了引人矚目的研究成果。這些研究主要集中在基于DNA微矩陣得到的基因表達譜從中篩選出腫瘤的分型檢測的生物標記,相關的研究成果都發表在國際一流雜志上,如本年度6月5日的《PNAS》Heping Zhang等的研究結果表明可以通過他們所創立的數學模型分析芯片數據,從表達譜數據中可以抽提出2-3個基因作為癌癥分型的生物標記;9月25日《PNAS》 Mike West等,其研究結果表明可以通過雌激素受體水平和淋巴結情況來區分乳腺癌的情況。本年度8月《Nature 》Saravavn M. Dhanasekaran等的研究結果表明可以通過hepsin 和pim-1兩個基因的表達情況來區分前列腺癌。2001年10月25日的《Nature》雜志發表了一篇通過微矩陣技術篩選到抗生素耐藥基因的文章;10月26日《Science》雜志發表了Q. Huang等的研究結果,通過微矩陣技術篩選了與人免疫反應有關的基因。這些工作為藥物的研發和疾病的診斷治療提供了堅實的基礎,他們的結果表現出了一些可實際應用的跡象,經過一到兩年的時間,即可為產業服務和應用到臨床上。
實際上,DNA微矩陣就是一個技術平臺,它的最大特點是高通量、微型化和數據處理的自動化。隨著DNA微矩陣技術的發展,芯片的標準化、樣本取得、處理和芯片雜交后的數據分析將成為人們關注的焦點。特別是芯片處理后的數據分析將決定誰可以從基因表達的海量信息中“網”到“魚”。基因組測序工作產生了巨大的基因序列數據庫,有關基因表達譜的研究,也將產生“transcriptomics”和相應的數據庫,這是基因功能組研究的起始。
微矩陣技術正在研究領域發揮著它自己應有的潛力并持續地發展,也昭示著蛋白芯片和Lab-on-chip的未來。無疑,后兩者在實際應用上將會體現的更直接。蛋白芯片與藥物的研發更接近,也貼近疾病的臨床檢測和診斷。“核酸+蛋白”的檢測將為病人提供更確切的治療方案。不過蛋白芯片的研發技術難度將超過DNA芯片。Lab-on-chip更是預示著一種美好的未來,其核心在于它的制造工藝上,如何來實現它對樣品處理到檢測分析的整合,如何來大幅度提高檢測的靈敏度和降低使用成本,這是它實現在臨床應用的最關鍵的因素。作為DNA芯片和蛋白質芯片其發展的動力主要是對芯片雜交后數據處理所獲得的結果,而Lab-on-chip的大幅度發展將來自于它的制造工藝。
可以分析出DNA芯片的最大應用領域是在科研(包括藥物開發),而不是人們所關注的臨床。美國主要的基因芯片公司Affymetrix與多家制藥公司合作,如deCODE,GlaxoSmithKline,Millennium等,研究開發基因芯片技術在藥物研發上的應用。DNA微矩陣從技術特點而言,并不適合在臨床的應用,因為:
1)DNA芯片所需的樣本量很大。按一般芯片試劑盒的要求,需要總RNA在20或50微克以上,國內一般要求提供mRNA為1-3微克。這樣的量在臨床上是完全不可能去做到的,解決的辦法就是通過PCR擴增得到足夠的標記探針。目前國內有些公司推出的臨床檢驗用芯片實際上是“多個PCR+基于microarray的雜交顯色”,而并沒有體現DNA芯片的優勢和特色,還不如直接用定量熒光PCR方法檢測來的方便、快速。
2)檢測靈敏度。按照芯片的檢測方法,其檢測的核酸拷貝數要多于PCR技術。
3)檢測對象。就目前而言,核酸檢測的對象比較缺乏。目前病原微生物的基因組研究并沒有全面的開展,有關的基因序列相比于人的還是很少。而對于內源性疾病的診斷芯片、基因預測芯片、基因分型芯片,需要有疾病的相應的生物標記----特定基因。用于診斷感染性疾病的亞型分型診斷芯片,對亞型的分析還未充分,并且由于目前還沒有相應的治療藥物,分型診斷也難以實現其臨床價值。耐藥性芯片,主要是通過檢測特定片段上的某個堿基是否發生了突變,雖然在方法上是比原有的要方便一些,但是實現在臨床的應用還有一段時間。由此決定了目前的診斷用DNA芯片的標志意義超過了現實意義。
4)實驗成本。而對于這些技術來說,成本永遠是一個值得考慮的問題。DNA芯片相對于一般的普通的分子生物學實驗的費用是要高的多,如果系統地進行微矩陣實驗,一般只有大型制藥公司和經費充足的科研院所才能承受。一套商品化的基因芯片分析系統,包括芯片陣列儀、掃描儀、計算機及其軟件等,大約價值11萬美元;如果購買芯片公司生產的產品則只需掃描儀和計算機及軟件,市場價目前為5-6萬美元。
芯片的市場價一般為1-2元人民幣/點,再加上每張芯片的耗材費用,合計大約在1000美圓左右。按照國際上發表文章,目前所需的數據處理量,需要芯片至少在二三十張或更多。根據目前國內的國家自然科學基金項目資助額度,一般為十到二十萬元,大的項目在一百萬元左右。所以在國內科研工作中,基因芯片的實際使用量還比較小,也就造成了國內沒有什么有關使用基因芯片的研究成果出現的現象。
但是,“淘金者”卻沒有得到相應的回報,DNA芯片碰到了冷落的態勢。DNA芯片的研究沒有形成國外那樣的大氣候,其原因之一是國內更多的是一種芯片概念的炒作。不可否認基因產業的復雜,投資大、周期長、風險高,但是它產生的利潤和實際對國家經濟的影響面將是非常大的。生物芯片技術所帶來的革命性的技術進步,并對人類的命運起到巨大作用,所以其未來的成長空間是巨大的。國外一些非生物技術公司正在加入基因芯片這一領域的發展,特別是摩托羅拉和惠普。